来源：医药魔方Pro

PROTACs全称为Proteolysis-Targeting Chimeras，即蛋白水解靶向嵌合体，是一种不同于抗体和传统小分子抑制剂的新药物类型，由3部分组成：靶蛋白binder、linker以及E3泛素连接酶binder。也就是说，PROTAC分子的一端与靶蛋白结合，另一端与E3泛素连接酶结合。而E3泛素连接酶可通过将一种叫做泛素的小蛋白贴在靶蛋白上将其标记为缺陷或受损蛋白。之后，细胞的蛋白粉碎机（即，蛋白酶体）会识别和降解被标记的靶蛋白。

近几年，作为调节蛋白稳态的一种新方式，PROTAC受到了学术界和工业界的广泛关注，很多团队正在积极开发基于PROTAC技术的蛋白降解剂。靶蛋白方面，有统计称，目前PROTAC针对的热门靶点有100多个，进展最快的包括AR-PROTAC、ER-PROTAC、BTK-PROTAC等；E3泛素连接酶方面，目前最常被用于PROTAC开发的有两种，分别是Von Hippel Lindau (VHL)和cereblon (CRBN)。其中，CRBN也是另一类在研蛋白降解剂——分子胶经过验证的靶点。

CRBN是CRL4 E3泛素连接酶的一部分，作为底物受体（substrate receptor, SRs）识别底物蛋白，从而启动降解过程。CRLs是E3泛素连接酶中最大的一个家族，通过将底物受体和适配器蛋白围绕不同的cullin骨架进行组装，形成了超过250种CRLs。

简单来说，分子胶降解剂是一类可诱导E3泛素连接酶底物受体（如CRBN）与靶蛋白之间新型相互作用，从而导致靶蛋白降解的小分子。沙利度胺、来那度胺和泊马度胺类小分子免疫调节剂是分子胶的一个显著例子，可重定向CRBN，从而使转录因子IKZF1和IKZF3多聚泛素化，导致IKZF1和IKZF3被蛋白酶体降解。类似地，抗癌磺胺类药物indisulam也可引导E3泛素连接酶DCAF15与RBM39之间的相互作用，促进RBM39的降解。总之，分子胶以及PROTAC技术的发展为靶向致病蛋白，包括许多利用传统的方法很难靶向的蛋白，提供了新策略。

4月4日，来自威斯康星大学麦迪逊分校的一个科学家小组在发表于European Journal of Medicinal Chemistry杂志上的一篇论文中公布了他们所开发的一款新型MDM2降解剂[1]。

MDM2，全称为双微体同源基因2（mouse double minute 2），是p53（一种强大的肿瘤抑制因子，人类癌症中突变最频繁的基因）的关键负调节因子，在肿瘤中高表达，对肿瘤的发生和发展起到重要的作用。先前的研究表明，MDM2不仅可与p53结合，以阻断其肿瘤抑制反式激活域，该蛋白本身还是一种E3连接酶，可标记p53，使其被蛋白酶体降解。由于约50%的人类癌症中保留着野生型p53基因，只是这些p53的肿瘤抑制功能被MDM2等信号分子削弱了，因此研究者们希望，通过开发小分子抑制剂或降解剂来阻断p53与MDM2之间的相互作用，携带野生型p53的患者能够恢复p53的抑癌活性。

在2019年8月，该科学家团队曾报道，他们开发了一款高效的MDM2-PROTAC——WB156[2]，WB156由nutlin衍生物和CRBN配体来那度胺连接而成（下图A；nutlin是最早被发现可以抑制p53–MDM2相互作用的小分子抑制剂）。在白血病细胞中，WB156能够有效耗尽MDM2，激活野生型p53，进而诱导细胞凋亡。不过，尽管WB156能够有效降解MDM2，诱导p53激活，显示抗增殖作用，但该分子只能在有限数量的白血病细胞系中起作用。

MDM2降解剂的设计。(A)MDM2降解剂WB156的结构、Ugi反应ligand1和ligand2；(B) Ugi配体与MDM2结合位点结合的共结晶结构；(C)从Ugi反应衍生配体和来那度胺衍生物构建MDM2降解剂的策略。（来源：European Journal of Medicinal Chemistry）

为了克服这一瓶颈，科学家们设想，融合不同的MDM2配体可能能够使MDM2降解剂在更广泛的癌症中起作用。在最新发表的这项新研究中，他们首先利用“MDM2 ligand 1”和“MDM2 ligand 2”（上图A）进行四组分Ugi反应制备了用于开发MDM2降解剂的配体，然后用这些配体作为MDM2的binder来构建活性MDM2降解剂。经过广泛的优化，WB214被鉴定为在各种白血病细胞系中最有效的抗增殖药物。

令人惊讶的是，机制研究表明，这种新型WB214降解剂并没有激活p53，相反的，WB214诱导了p53的降解，这与该团队先前报道的MDM2降解剂WB156完全相反。

科学家们进行了一系列实验来调查导致这种效应背后的潜在作用机制。结果显示，1)WB214介导的MDM2-p53复合物降解是通过泛素-蛋白酶体系统实现的；2) p53在MDM2降解过程中是一个旁观者，因为它与MDM2直接相关，因此产生了“旁观者降解效应”；3) WB214-CRBN复合物不在p53结合位点与MDM2结合（相比之下，MDM2 ligand 1或WB13均在p53结合位点与MDM2结合）。

由于三元复合物的形成是蛋白酶体降解的前提，因此，研究者们进一步分析了WB214诱导三元复合物形成的情况，并证实WB214能够以剂量依赖性的方式有效诱导三元复合物的形成，且相比WB156，WB214诱导了更强的CRBN-MDM2相互作用(下图D)。这些数据表明，与WB156(真正的MDM2 PROTAC)不同，WB214并不是通过经典的PROTAC机制降解MDM2。WB214的作用机制与分子胶更一致。换句话说，WB214只是通过与其CRBN相互作用导致与MDM2结合。作者们称，这是首次发现MDM2可以作为CRBN的新底物（neo-substrate）。

接着，研究揭示，WB214降解p53后依然能够抑制白血病细胞生长是因为，这款降解剂还能够有效降解GSPT1。GSPT1全称为G1 to S phase transition 1，也被称为eRF3a，通过与释放因子eRF1相互作用，介导终止密码子识别和新生蛋白从核糖体释放。先前有研究显示，GSPT1作为CRBN的新底物（neo-substrate），可被CC-885或ZXH1-161(来那度胺衍生物)有效降解，导致白血病细胞增殖被显著抑制。也有报道称，GSPT1是招募CRBN的PTOTAC分子产生脱靶效应的一种原因，例如Crews教授及其同事发现，基于沙利度胺的c-Met PROTAC分子诱导GSPT1降解。此外，也有团队通过对MDM2 PROTAC分子的简单结构修饰意外发现了可降解GSPT1的分子胶（MG-227）。MG-227仅显示中度MDM2降解作用，但具有非p53依赖性的高效细胞生长抑制作用，最终研究确定MG-227的靶点为GSPT1。综合这些先前的研究不难看出，GSPT1是CRBN常见的新底物，它对抑制细胞增殖有重要作用。

因此，在这项研究中，威斯康星大学麦迪逊分校的科学家们也检测了WB214是否也降解了GSPT1。结果显示，相比MDM2和p53，WB214对GSPT1的降解作用最强，能够以剂量依赖的方式消耗GSPT1。

白血病细胞降解特征（Western blot分析）。(A)细胞用DMSO或指定化合物处理6小时后MDM2、p53 和GSPT1的免疫印迹分析；(B) 细胞用DMSO或指定浓度WB214处理12小时后 GSPT1的免疫印迹分析。（来源：European Journal of Medicinal Chemistry）

最后，科学家们尝试开发MDM2或GSPT1选择性降解剂，通过改变WB214的不同基序，他们发现，尽管效力较弱，但“化合物36（compound 36）”能够选择性降解GSPT1。研究者们表示，接下来，他们将开展进一步研究，提高GSPT1选择性降解剂的效力，同时开发优先降解MDM2的化合物。

在论文的讨论部分，作者们指出，这项工作给他们带来的一个很重要的教训是，在开发蛋白降解剂时，与靶蛋白（如MDM2）结合的蛋白质（如p53）也可能作为“旁观者”被降解。迄今为止报道的大多数新底物都是CRBN的，而随着被用于开发蛋白降解剂的E3泛素连接酶家族变得更加壮大，脱靶效应可能发生得更多。

参考资料：

[1] BoWang et al. Development of MDM2 degraders based on ligands derived from Ugi reactions: Lessons and discoveries.European Journal of Medicinal Chemistry(2021).

[2] BoWang et al. Development of selective small molecule MDM2 degraders based on nutlin. European Journal of Medicinal Chemistry(2019).