文 | 科志康 原创 | 双胍

批量纯化mRNA（原料药）的生产和控制

建立并证明批量纯化mRNA的特性、纯度、数量和物理状态、安全性和质量的关键质量属性规范。应提供所用分析方法的说明，规定验收限值，以及分析验证信息。总结并提供以商业规模生产的所有批次的测试结果。还应制定储存条件下的稳定性规范。

在开发初期，为了支持IND，应总结并提供根据GMP生产的批次测试结果，以及为建立生产程序而进行的大试（如有）。尽管规范可能有限，并且在早期开发中有一些广泛的验收标准，但在适当的情况下，随着在生产过程和分析方法方面经验的积累，应该对这些规范进行审查和收紧。并非所有在产品表征期间进行的测试都需要在每批疫苗上进行放行测试。一些测试只需要获得有限批次的产品和工艺知识，以确定生产方法和一致性。因此，应对最初的商业规模生产批次进行综合分析，以确定原料药的特性、纯度、质量、安全性和稳定性的一致性；此后，按照与监管部门达成的协议，一系列的有限测试可能适用于质量控制。

随着在生产一致性方面获得经验，批准后的变更可能会允许通过使用工艺验证、产品特性和/或可比性方案来减少测试和所需支持信息的数量

1、鉴定

每批批量纯化的mRNA都应进行测试鉴定。鉴定包括通过直接RNA测序、逆转录PCR（RT-PCR）产物测序（或确定是否存在）或高通量测序来确定mRNA序列。如果鉴定基于RT-PCR扩增子，仅代表完整mRNA序列（包括辅助区和调节区）一部分，则所选序列应为该mRNA产品所独有，而不是在同一设施或使用同一设备制造的任何其他产品所共有的序列。然而，对整个mRNA进行测序可能更合适，因为这种方法可以解决鉴定和潜在纯度问题，这取决于所使用的测序方法。

2、纯度和杂质

每批批量纯化的mRNA应进行纯度测试，结果应在规定允许范围内。杂质的控制还应针对制造过程中引入的材料，如DNA模板、未结合核苷酸、未结合帽、酶、mRNA片段和dsRNA。这可以通过工艺验证来确定工艺相关杂质的去除，或者通过残余杂质的放行试验来实现。考虑到检测dsRNA的必要性，应考虑到生产过程的设计，因为并非所有过程都会产生dsRNA。分析应包括对工艺和产品相关杂质的敏感和可靠分析，并为批量纯化mRNA中的杂质含量规定严格的上限（最大允许值）。可以考虑使用色谱检测方法。残留DNA模板可通过定量PCR进行定量。重要的是，用于证明纯度和测量杂质的技术应基于尽可能广泛的物理化学、生物和/或分子特性。强制降解研究等方法的结果，可以指导决定哪些产品相关杂质需要在生产过程中、放行时和/或稳定性方案中进行测试和/或测量。

如果监管部门同意，一旦生产工艺已充分验证其适当去除，且已证明生产一致性，作为质量控制一部分的工艺或产品相关杂质残留水平测试可能会减少或停止。应说明定期重新验证过程的计划和规范。在工艺验证之前，应按照监管部门的同意，继续对杂质进行测试和/或测量。如果生产发生重大变化，预计将对与监管部门商定的批次数量进行重新验证或继续测量。在BLA时，还应评估和讨论容器封闭系统的相容性、可浸出物和可提取物。

3、定量和物理状态

mRNA结构的完整性被认为是mRNA释放的关键质量属性。因此，需要控制mRNA完整性、5’加帽效率、3’聚(A)尾的存在或长度、完整mRNA百分比、mRNA片段百分比、dsRNA百分比等。需要测量3’聚(A)尾的存在或长度取决于该序列添加到mRNA的方式。如果编码在DNA模板中，则所有全长mRNA应包括聚(A)尾，但如果在IVT后以酶促方式添加，则适合通过测试或工艺验证来确认该属性。同样，dsRNA的存在取决于所用工艺是否会产生它。出于这些目的，可以考虑使用凝胶电泳、PCR或色谱检测方法。应该记住，mRNA的定量是疫苗剂量的基础，完整mRNA的存在是疫苗作用机制的关键。因此，应描述用于量化mRNA（例如，紫外分光光度法）和用于量化完整mRNA（例如，凝胶电泳）的方法。

4、安全属性

应说明相关的安全测试，可能包括内毒素测试，细菌和真菌无菌性测试（包括证明供试品缺乏杀菌或杀菌活性）或微生物生物负荷测试（包括数量、微生物种类鉴定和不含特定有害生物）。监管部门通常不要求对原料药进行此类测试，但如果需要，可对药品进行热原性测试（可能是单核细胞活化测试）。只要有其他令人满意的试验可用且允许，应避免进行动物试验。出于科学和伦理原因，最好应用3Rs“替换-减少-精炼”的概念，以尽量减少试验中使用动物，并应考虑使用适当的体外替代方法进行安全性评估。

5、其他质量属性

应建立并控制其他重要质量属性（如外观、pH值和粘度（如相关））。

6、标准物质

应建立内部参考制剂（即工作标准），用于分析标准化和可比性评估。在BLA时，应提供用于测试批量纯化mRNA的参考标准或参考材料的信息。

合适批次（即已进行临床评估的批次）应在其化学成分、纯度、生物活性和完整序列方面进行充分表征，并保留足够的样品作为化学和生物参考材料。标准物质应以适当的形式配制。应在稳定的条件下储存。实施常规计划，以监测材料的稳定性。耗尽后更换初始参考物质的计划应与监管部门达成一致。

在早期开发（例如，初次临床试验）中，大试批次或关键非临床研究中评估的mRNA疫苗批次可作为参考，直到确定合适的临床试验批次，并对其进行表征，以作为高级开发（例如，关键临床试验）和商业试验的参考。无论采取什么方法，都应该清楚地描述。

7、稳定性

进行稳定性评估的研究类型、遵循方案和研究结果都应以适当格式进行总结。总结应包括有关适当储存条件或保质期的结果和结论。支持散装（或储存中间体）保质期的稳定性数据以及其未来的任何延长应基于实际条件下的长期实时稳定性研究。对于中间体或原料药的运输，预计将在适当的储存温度和条件下进行装运验证。

最终配方疫苗（药品）的制造和控制

疫苗开发和生产概述应包括说明性和注释性流程图，以及对生产、过程中控制和放行试验的叙述性描述。详细说明用于确保LNP正确形成的方法。规定和验证散装配方或散装LNP的任何拟定保存时间。充分考虑确保在保存时间内的理化稳定性和微生物控制。描述并适当验证用于最终配方、填充和完成的方法。

1、组成

疫苗的最终成分，包括活性药物（mRNA）和所有辅料（例如，脂质），应与每次展示的成分数量一起描述——尤其是如果正在寻求一种以上剂量或剂型的上市授权。还应说明每种成分的功能。

2、LNP生产、控制以及mRNA的封装

描述用于确保LNP正确形成的方法。提供适当的产品开发数据支持其拟定配方和生产工艺的基本原理。调查LNP和最终mRNA-LNP的所有关键质量属性。合适时，可以采用实验设计（DoE）方法。它们的大小和多分散性，以及稳定性，都受到脂质和水相的流动动力学以及制造过程中产生的剪切应力的影响。因此，应开展相关研究，探索mRNA-LNP配方的关键工艺参数及其最佳操作范围，以及最终配方疫苗的稳定性，确保产品始终按照要求的质量生产。散装LNP或散装配方的拟定保存时间应适当说明和验证。这些是生产最终配方疫苗的重要中间产物，如需储存，应适当控制，充分考虑以确保在保存时间内的理化稳定性和微生物控制。

脂质的制备、将mRNA与脂质一起封装到LNP中、稀释和纯化步骤，以及随后填充到合适容器中，验证该过程以满足必要的过程中规范。考虑使用各种过滤技术（例如，切向流过滤）去除制备LNP所用的原材料。特别注意，封装到LNP期间，以及在已知影响LNP和最终mRNA-LNP疫苗产品稳定性的制造条件下（例如，mRNA解冻和LNP或mRNA LNP的冷冻速率的影响），尽量减少mRNA的降解。如果冻干，应考虑冷冻干燥和重构的条件并证明其合理性。如适用，应说明稀释剂或重组溶液。

规定LNP的适当控制措施，通常包括：a）脂质的特性、数量和纯度（包括杂质）；b） 颗粒大小和分布（多分散性）；和c）RNA包封效率/包封比例。在某些情况下，可能还需要指定表面性质（例如电荷）、脂质摩尔比或阳离子脂质与mRNA之比（例如氮磷比），以确保产品的一致性和稳定性。

对mRNA原料药的任何改变（例如，序列、长度或二级结构的改变）可能对LNP的关键质量属性（例如，粒径和分布、形态和表面性质）以及最终对最终疫苗产品产生的后续影响（例如，包封率和细胞相互作用/摄取）。相关开发数据有望证明产品的一致性，并支持产品优化过程。同样，如果平台数据旨在支持新候选疫苗的开发，则应确定新mRNA原料药对最终疫苗产品关键质量属性的影响。

3、最终疫苗（药品）的制造、灌装和容器

提供带注释的流程图，说明从批量纯化的mRNA（原料药）到最终疫苗（产品）的制造步骤。流程图应包括所有步骤（即单元操作），如散装最终配方的稀释、材料和中间体的鉴别，以及过程中和质控测试。提供流程图中每个步骤的叙述性描述。还应包括以下信息：规模、缓冲液和其他添加剂、主要设备和过程控制（包括过程中测试和关键工艺操作参数，相关开发数据证明的验收标准），以及灭菌过程和微生物控制的详细信息。

充分验证mRNA-LNP的无菌填充过程，以确保所有关键质量属性得到维护，并符合要求的规范。注意确保容器和封盖（以及转移装置，如适用）所用材料不会对疫苗质量产生不利影响。为此，容器密封完整性测试和评估最终容器密封系统的可提取物和/或可浸出物通常是容器鉴定所必需的，并且可能需要作为稳定性评估的一部分。

如使用多剂量瓶，且疫苗不含防腐剂，则其使用应受时间限制，就像卡介苗（BCG）和麻疹疫苗等重组疫苗一样。此外，多剂量瓶应能防止打开后内容物受微生物污染。可能需要对容器封闭系统进行相关模拟研究（例如，多次穿刺试验），以证明拟议系统的适用性。多剂量瓶的设计应符合标签要求，为得到正确剂量，允许可接受的过量。评估最大预期穿刺导致对完整性的损害风险和污染可能性。验证多剂量瓶的可提取体积。如果多剂量瓶用于稀释浓缩液，应用建议的稀释溶液进行额外的兼容性研究，确定适当稀释后的保存时间。列出稀释前和稀释后规格并证明。制造商应向监管部门提供足够的数据，证明产品在适当储存、分销和使用条件下的稳定性。

当最终疫苗包含一种以上的mRNA时（例如，在组合或多价疫苗中，或者由单独mRNA组成的sa mRNA中），可能会有额外考虑。其中一个考虑因素是确保配方中不同mRNAs的适当比例，以优化每种mRNAs表达，并将免疫干扰降至最低（在组合或多价疫苗的情况下）。另一个需要考虑的问题是，在封装到LNP中之前，是否将mRNA混合，或者是否将每个mRNA单独封装到LNP中，然后制备两个或更多mRNA-LNP的混合物。在任何一种情况下，都应该用相关数据来描述和证明所选择的方法。

4、最终疫苗（药品）的控制

每个最终疫苗批次中样本都应被评估。所有测试和规范均应获得监管部门批准。最终疫苗规格由制造商制定并证明合理。原则上，最终规格应根据临床研究中证明具有可接受性能的相关批次数据确定，提供疫苗分析方法和接受限度的说明，包括方法验证信息。测试建议包括鉴定、纯度、含量、安全性、附加质量属性和效力评估。还需建立稳定性，以证明所要求的有效期。

在早期开发阶段，规范可能有限，并且验收标准有些广泛，但在获得制造过程和分析方法方面的经验后，应在适当时对其进行审查和加强。

提供商业规模生产的所有批次的测试结果摘要。开发早期，为了支持IND，应总结并提供遵循GMP生产的测试批次以及，如可用，为建立工艺流程而进行的大试结果。

并非所有在产品开发期间进行的测试都需要在每批商业规模生产的疫苗上进行。一些测试仅用于获取有限系列批次的产品和工艺知识，以建立生产一致性。应使用经验证的方法对连续几批疫苗（最终剂型）进行测试和分析，以确认生产一致性，注意并调查一个批次和另一个批次之间任何具有统计意义或科学意义的差异。从这些研究中获得的数据，除了产品、工艺知识和特定属性变化的关键性评估，不同批次的临床试验结果和对特定属性变化的关键性的评估，应作为定义疫苗规格和用于常规批次放行的验收标准的基础。因此，应对最初的商业生产批次进行全面分析，以确定mRNA疫苗的特性、纯度、强度/含量/数量、安全性、附加质量参数、效力和稳定性方面的一致性，但此后如与监管部门达成一致，则更有限的测试系列可能是合适的。

随着在生产一致性方面获得经验，批准后的变更可能允许通过使用工艺验证、产品特性和/或可比性方案，减少所需的测试和支持信息量。

4.1鉴定

每批疫苗都应接受适当测试，以确认最终产品，并将其与在同一设施或使用同一设备生产的其他产品区分开来。如果疫苗包含一种以上的mRNA，则应确认每个mRNA。考虑通过序列分析确认mRNA。

4.2纯度和杂质

评估每批最终疫苗的纯度，并证明其在规定限度内。考虑输送系统组件产生的潜在杂质，并控制杂质的各个方面，如最终疫苗中的氧化和降解。单次检测不太可能足以检测所有潜在杂质。应考虑mRNA完整性、颗粒大小、脂质/聚合物杂质以及LNP中包裹的mRNA的比例/效率的测试。容器封闭系统的兼容性、可浸出物和可提取物也应在BLA中进行评估和讨论。

4.3含量、强度或数量

mRNA疫苗的剂量取决于mRNA的重量。因此，除了评估效力，还应描述mRNA的定量方法。如果疫苗包含一种以上mRNA，则应测量每种mRNA数量，并确认每种mRNA与另一种mRNA的比率符合预期，且未超过总mRNA剂量。

4.4安全属性

每批最终疫苗都应进行细菌和真菌无菌测试（包括证明供试品缺乏抗真菌或细菌活性）。如果疫苗通过非肠外途径接种，那么省略无菌检测和纳入适当的替代微生物生物负荷检测需要有适当的理由。此外，应对每批产品进行内毒素测试，并确定适当的规格。如果监管部门要求，可进行热原性试验（可能是单核细胞活化试验）。只要有其他令人满意的试验可用且允许，应避免进行动物试验。出于科学和伦理原因，最好尽量减少在试验中使用动物，并应考虑使用适当的体外替代方法进行安全性评估和其他产品控制试验。WHO生物标准化专家委员会2018年决定不再将一般安全性（无害性）试验纳入世界卫生组织建议、指南和其他生物产品指导文件中所有疫苗的常规批量放行试验要求。

4.5其他质量属性

建立和控制其他重要的质量属性，可能包括外观（存在的可见和亚可见颗粒物）、可抽取体积和pH值。根据产品特性，控制渗透压或粘度等其他属性也可能很重要。对于最终疫苗（药物产品），其他属性包括脂质/聚合物鉴定和含量、纳米颗粒大小、mRNA-脂质比率和多分散性指数。

关于纳米颗粒大小，应采用与基于纳米颗粒治疗产品类似的多点控制，以及详细说明用于测量颗粒大小的试验，因为结果取决于所用的分析方法。LNP中mRNA的包封程度也应被视为一个关键的质量属性，因为未包封的mRNA被认为是不稳定的。应确认最终产品的结构不会因冻融和稀释而改变。凝胶或毛细管电泳和/或高效液相色谱等已用于纯度或鉴别的技术也可能有助于评估某些质量属性。

可能需要进行其他测试（如疫苗冻干后残留水分测试），以确认产品和配方的物理特性。说明所用分析方法的验证，以确保控制已识别的药品关键质量属性。

4.6效力

每批最终疫苗的效力应使用适当的定量和经验证的功能性方法确定。可能需要不同的测试来控制效力（包括功能性）的各个方面，这可能是疾病特异性的。疫苗受体的免疫原性是最终疫苗特性的一个复杂功能，包括通过其配方输送到靶细胞，以及mRNA编码蛋白的表达。因此，潜在的体外效价检测可能包括基于细胞的转染系统或无细胞检测，证明正确的蛋白质是从mRNA表达的。然而，由于效力分析不仅应基于产品类型，还应基于待预防疾病的临床指征，因此不可能指出应用于测量效力的特定分析方法。与所有质量控制测试一样，应提供选择用于控制产品的效力测试的科学依据，并与临床表现相关联。

当开发针对新菌株的新候选疫苗时，应考虑确保使用的效价测定对菌株变化有效。

mRNA疫苗的效力规格应根据临床试验中用于证明有效性的最低剂量以及人类免疫原性数据来设定，还应根据可用的人身安全数据确定上限。

基于动物的分析往往是高度可变的，难以验证。因此，考虑使用适当的体外替代方法进行效力评估。据设想，与质粒DNA疫苗一样，可以使用生化或生物物理测试（如核酸量和mRNA完整性）的组合来建立和监测mRNA疫苗的效力。鼓励制造商努力实现采用适当定量和评估功能的体外分析的目标。然而，需要承认以上只考虑了mRNA，而未考虑配方、佐剂、免疫调节剂等的影响，因此需要考虑具体mRNA疫苗的效力评估。因此，建议讨论适当的效力测试，并与监管部门达成一致。

4.7标准物质

经过临床评估的最终疫苗的适当批次应在其化学成分、纯度、生物活性和全序列方面进行充分表征，并保留为内部参考材料。该材料作为商业生产批次产品质量评估的基础。

将来，监管部门可能制定和提供国家标准，而WHO可能提供国际标准。如果此类标准可用，则必须根据这些标准校准内部参考材料。需要制备新的参考材料时，可以以更可靠的方式进行比较。此外，在适当的情况下，以通用单位（如IU）表达结果也将允许比较从不同实验室获得的测试结果，以及基于相同或类似技术针对相同病原体的不同产品的测试结果。

4.8稳定性试验、储存和有效期

初次包装和二次包装上关于储存温度和有效期的声明应基于实验证据，并提交监管部门批准。

稳定性

充分的稳定性研究是疫苗开发的重要组成部分。为了支持商业用途，应确定拟用容器中最终产品的稳定性，并将结果用于在适当的储存条件下设定保质期。测量表明稳定性的属性，可能包括外观（可见和亚可见颗粒物）、mRNA数量、疫苗效力、mRNA完整性、包封程度、粒径、多分散性以及与mRNA和脂质相关的杂质。描述待测量的属性，定义和证明规范。为此，应进行实时稳定性研究。高温下的加速稳定性研究可能会为产品的稳定性提供额外和补充的支持证据，并确认用于确定稳定性的分析的稳定性指示性质。如果考虑在高于冰点的温度下长期储存（例如>6个月），这可能需要额外的分析测试，以评估潜在的脂质氧化或其他此类变化，以及这些变化对效力的影响。

此外，可以考虑加速和压力测试数据以及平台数据，以支持保质期。应生成支持临床使用的稳定性数据，例如短期储存和配药的高温稳定性数据。对于多剂量小瓶，需要使用中的稳定性数据来保证所需的微生物质量和疫苗在使用条件下的稳定性。

在最初的临床开发过程中，预计稳定性信息有限。例如，一些监管机构在申请临床试验授权时，接受在临床试验用容器中拟用于临床试验的最终疫苗批次的3个月实时稳定性，或以相同方式在相同类型和大小、相同规格容器中生产的疫苗，但这应该得到监管部门的同意。初始临床开发也可以通过包括使用加速稳定性评估计划的预测稳定性建模结果来支持。同样，平台技术上的稳定性数据可以支持基于该平台的新候选疫苗。

如果建议长期储存在深冻条件下，则应探索替代短期储存条件（如冷冻和/或冷藏），以支持疫苗分发和分配。同样，也可能会进行温度漂移研究或运输模拟研究。评估和讨论容器封闭系统与储存稳定性的兼容性（包括关于可浸出物和可萃取物的兼容性）。应考虑开发更耐热的疫苗配方，以提高其全球效用。

储存条件

验证储存条件。从生产机构或储存地点发放疫苗之前，疫苗的储存时间和/或温度不得超过制造商证明的与最小效力损失相容的温度。根据稳定性研究结果，经监管部门批准后，应确定最长储存时间，并应确保最终产品的所有质量规范保持到保质期结束，包括容器或包装上规定的最低效力。临床试验期间，理想情况下，这段时间应至少等于完全登记临床试验中疫苗接种阶段的预期持续时间。

有效期

有效期应根据实时稳定性研究支持的最终容器保质期确定，并由监管部门批准。有效期应基于最终配方散装的混合日期、灌装日期或最终批次的第一次有效效力测试日期（视情况而定），并与监管部门达成一致。

保留足够数量的样本，以备将来的研究和需要。这些需求可能包括但不限于生产调查或开发、非临床研究或未来的桥接临床试验。关键临床试验中使用的疫苗批次可作为参考材料，应为此目的适当保留和储存足够数量的疫苗瓶。需要提前规划，以便保留关键临床试验批次中适当数量的容器。