DNA甲基化是一种重要的表观遗传机制，不同的DNA甲基化谱与细胞类型、发育阶段和疾病状态相关。单细胞亚硫酸氢盐全基因组测序（scWGBS）是一种在组织水平和全基因组水平上通过单核苷酸分辨率破译细胞甲基化异质性的强有力方法，目前已有多种平台被开发应用，例如scBS-seq、snmC-seq、sciMET。

虽然可以通过并行或长时间运行多个进程来处理较大数量的细胞，但这些平台本质上并不具备高通量属性。相比之下，液滴微流体可以快速产生和操作数百万个液滴。作为分离和处理单细胞的微反应器，液滴微流体已成功地用于高通量的RNA-seq、DNA-seq、ATAC-seq等。但现有的单细胞甲基组学技术仍然是基于试管或孔板，很难进行高通量测序。

近日，来自美国弗吉尼亚理工大学等单位的研究团队在Nature Communications发表了题为“Droplet-based bisulfite sequencing for high-throughput profiling of single-cell DNA methylomes”的文章，报道了新开发的基于液滴的高通量单细胞亚硫酸氢盐测序平台（Drop-BS）。Drop-BS利用液滴微流体技术实现了超高通量，并可在2天内制备多达10000个单细胞的亚硫酸氢盐测序文库。研究团队将Drop-BS应用于混合细胞系、小鼠和人类脑组织，揭示了细胞类型的异质性。Drop-BS为检测庞大细胞群的单细胞甲基组学研究提供了一个颇有前景的解决方案。

文章发表在Nature Communications

Drop-BS工作流程

Drop-BS利用液滴微流体的多功能性，可对单细胞和条形码进行配对，并在混合各种试剂的液滴中进行多步反应。简单地说，通过操纵液滴中的单个细胞和单个条形码，来自单细胞的DNA被独特的条形码进行标记。然后，条形码DNA在液滴中进行亚硫酸氢盐转换，转换后的DNA最终进行PCR生成测序文库。Drop-BS包括五个主要步骤和三个微流控装置，从单个细胞核中生成与Illumina兼容的亚硫酸氢盐测序文库。

Drop-BS可以处理大量的细胞或细胞核，其scDNA液滴生成速率为~3000液滴/秒，条形码液滴生成与scDNA液滴融合的速率为~132液滴/秒。在处理~2000个细胞（包含~20000个条形码和~574000个液滴）的标准操作中，研究人员对微流控装置的操作在1.3小时内完成。整个方案需2天的时间完成。通过增加微流体设备的运行时间或在液滴融合的情况下运行多批次的实验，一个操作人员可以在2天处理多达10000个细胞。

图1. Drop-BS工作流程图。

Drop-BS性能验证

为了评估由Drop-BS产生的单细胞甲基化数据纯度，研究团队首先进行了一个物种混合实验，将人细胞系GM12878细胞核与小鼠脑细胞核按1:1比例混合，制备了约1000个细胞的亚硫酸氢盐单细胞测序文库。在选择细胞相关条形码后，共获得了741个高质量的条形码单细胞数据，其中绝大多数的reads比对到人类hg19基因组（n = 445）或小鼠mm10基因组（n = 266）。数据表明，Drop-BS平台有效地限制了液滴间的串扰，并产生了高纯度的单细胞数据集。

随后，研究团队用三种不同类型的细胞株制备了Drop-BS文库，并将三种细胞株等量混合。通过添加300个已知的单细胞数据（每个细胞株100个）进行了聚类分析，以检测聚类是否能够将特定的细胞分配给特定细胞株。结果显示，聚类结果是基于三种细胞类型不同的mCG水平（胞嘧啶和鸟嘌呤的甲基化），而不是每个细胞的reads。单细胞数据的聚类与其对应的细胞株数据和已发表的细胞株甲基化组学数据具有较高的相关性。

图2. Drop-BS用于鉴别混合样本中的不同细胞类型。

Drop-BS在脑组织样本中的应用

研究团队将Drop-BS技术应用于研究来自小鼠和人类的前额叶皮层（PFC）样本。与GM12878细胞、HEK293细胞和MCF7细胞相比，大脑样本中mCH水平较高。在剔除低质量数据后，研究人员生成了包含1123个小鼠PFC单细胞甲基化的数据集，发现了7个细胞亚群。然后，研究人员结合每个细胞亚群中所有细胞的数据，对经snmC-seq分析的神经元类型特异性CG-差异甲基化区域（DMRs）的CG甲基化水平进行了计算。

在小鼠PFC样本中，研究发现第5和第7细胞亚群是兴奋性神经元，因为它们在兴奋性神经元特异性CG-DMRs中的CG甲基化水平低于抑制性神经元特异性CG-DMRs；细胞亚群2、3和6被鉴定为抑制性神经元。细胞亚群1和4与非神经元细胞相关，因为它们比大多数神经元特异性CG-DMRs显示出相当高的甲基化率。

图3. Drop-BS在小鼠脑组织样本中的应用。

此外，研究还分析了两份死亡大脑样本。人类大脑1（HB1）生成了1556个单细胞甲基化数据；人类大脑2（HB2）生成了1257个单细胞甲基化数据。研究人员分别对两个数据集进行降维聚类分析，HB1 Drop-BS数据产生了5个细胞亚群， HB2数据产生了6个细胞亚群。将两个数据集进行整合分析，并结合2813个单细胞甲基化数据，最终得到7个细胞亚群，并且单个人脑数据集生成的所有聚类都可以映射到合并数据集。

基于CG甲基化分数在人类神经元类型的CG-DMRs得分，研究人员确定细胞亚群3为抑制性神经元，细胞亚群1、4、5为兴奋性神经元，细胞亚群2、6、7为非神经元细胞。对兴奋性神经元细胞亚群和抑制性神经元细胞亚群的差异分析发现了637个DMRs。

图3. Drop-BS在人类脑组织样本中的应用。

据悉，Drop-BS是截至目前第一个被报道的基于液滴的高通量平台，以用于构建DNA甲基化分析的单细胞亚硫酸氢盐测序文库。Drop-BS利用了液滴微流体速度快的优点，在数小时内处理数百万液滴。这种速度允许在2天内产生多达10000个亚硫酸氢盐单细胞测序库，并且Drop-BS数据对细胞系和脑组织样本的平均映射效率为~72%和~63%。因此，该技术可为研究单细胞甲基化提供了高通量和可扩展的方法。

参考资料：

Zhang, Q., Ma, S., Liu, Z. et al. Droplet-based bisulfite sequencing for high-throughput profiling of single-cell DNA methylomes. Nat Commun 14, 4672 (2023).https://www.nature.com/articles/s41467-023-40411-w