Cell Res:西湖大学高晓飞团队开发新的平台,以用于血栓性疾病治疗中的应用

时间:2023-09-14 23:00:55   热度:37.1℃   作者:网络

红细胞(RBCs)是人体内最丰富的细胞。由于其独特的生物学特性,红细胞作为体内给药系统已被广泛研究。

2023年9月4日,西湖大学高晓飞团队在Cell Research在线发表题为“Development of a highly-efficient erythrocyte-drug covalent conjugation platform and its use in treating thrombotic disorders”的研究论文,该研究开发了一种高效红细胞-药物共价偶联平台,以用于血栓性疾病治疗中的应用。

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红细胞缺乏核,在血管中循环,寿命为120天红细胞具有良好的生物相容性和较大的表面体积比,是运载多种药物分子的理想囊泡。先前的研究已经探索了几种利用红细胞和红细胞启发的给药系统给药的方法。利用红细胞给药的一种方法是利用渗透压暂时打开细胞膜并包封药物以实现缓释。然而,这种方法会破坏细胞膜,从而限制了其长期治疗的效果。另一种方法是使用非共价键将药物附着在红细胞表面,如抗原-抗体结合。然而,药物在进入体内后可能很快就会从细胞表面脱落,这使得它很难达到持久的治疗效果。第三种方法是将药物吸附到红细胞表面,但这种方法同样受到非共价结合的限制,导致药物在几分钟到几小时内与细胞分离。

细菌的分选酶是一种转肽酶,能够以共价和位点特异性的方式修饰蛋白质来自金黄色葡萄球菌(wt SrtA)的分类酶A识别LPXTG基序并在苏氨酸和甘氨酸残基之间切割形成共价酰基酶中间体。这种中间体被细胞表面的亲核N端3×甘氨酸残基分解,同时在底物和细胞之间形成肽键。SrtA可以将多肽共价结合到红细胞表面,但这种方法需要从造血干细胞和祖细胞中工程化红细胞,使其过度表达具有LPXTG基元的膜蛋白。因此,SrtA的使用受到衬底基序严格要求的限制。

为了克服这一限制,作者探索了SrtA变体(mg SrtA)的使用,该变体已被证明可以识别N端具有单个甘氨酸的肽(1x甘氨酸修饰肽)与wt SrtA(1倍甘氨酸vs 3倍甘氨酸)相比,mg SrtA在底物识别方面的限制性降低,提高了与天然存在于红细胞表面的膜蛋白结合的可能性。研究发现mg SrtA成功地催化了生物素- LEPTG肽在人红细胞表面的偶联。

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机理模式图(图源自Cell Research

为了进一步应用,需要更高的蛋白质浓度来结合足够数量的有效载荷。因此,作者设计了一种策略,将修改后的链接器添加到有效负载中。首先,通过一个酯连接用2-羟基乙酸取代苏氨酸和甘氨酸残基之间的酰胺键来修饰LPETG基序。研究结果表明,生物素-LPET*G(*代表2-羟基乙酸)的偶联效率高于未修饰的生物素-LEPTG。此外,通过在C端添加半胱氨酸来修饰蛋白质负载。这种半胱氨酸提供了一个自由的巯基,允许化学偶联到一个不可逆的连接剂。与eGFPLEPTG相比,在eGFP中加入不可逆连接体(eGFP-LEPT*G)显著提高了其偶联效率。

在建立了有效的偶联平台后,我们开始研究这种红细胞修饰方法的药理学潜力。作者发现该方法能够实现药物负荷增加800倍,在每个红细胞上检测到3.00 × 104拷贝的pro-uPA-Cys-LPET*G和3.85 × 102拷贝的pro-uPALPETG。另外,数据表明,pro-uPA红细胞具有有效的溶栓活性,并有选择性地溶解新生凝块。使用这种方法修饰红细胞可以显著提高红细胞治疗药物在体内的稳定性,从而解决目前红细胞药物偶联物不稳定的挑战。

总之,在该研究中,通过使用mg SrtA和一种不可逆连接体,在红细胞上构建的亲uPA分子比以前的研究多800倍。此外,具有更高负载的pro-uPA-红细胞显示出与天然红细胞相似的半衰期,这表明缀合过程不会对红细胞造成明显损伤。在多种临床前疾病模型(包括DVT和PE)中,pro-PA-RBC显著提高的载药效率和半衰期是其有效解决血栓形成条件的关键因素。综上所述,该研究开发了一种有效的红细胞工程策略,允许药物分子与红细胞稳定结合,在体内循环正常半衰期的红细胞。这种血管内限制性红细胞药物载体技术作为广泛的心血管和代谢疾病的潜在治疗选择具有很大的前景。

原文链接:

https://www.nature.com/articles/s41422-023-00868-2

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