前言

嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法是一种过继细胞疗法，自体T细胞通过基因工程表达CAR以特异性杀死肿瘤细胞。自体CD19靶向CAR-T细胞目前已获得大多数主要监管机构的批准，包括美国食品药品监督管理局（FDA）、欧洲药品管理局（EMA）和中国NMPA。这些CAR-T细胞改变了临床实践，显示出强大的抗肿瘤活性，

然而，在实体瘤患者中开发具有临床实用性的CAR-T细胞仍然面临重重困难，原因在很大程度上是未知的。有许多可能的原因，包括：（1）特异性不足的靶抗原；（2） 递送不力；（3） 短持续性；（4） 效应器功能丧失；和（5）肿瘤抗原异质性。

因此，有必要从过往的CAR-T临床前和临床研究中汲取经验教训，分析CAR-T细胞技术的要素和挑战，并将基础、临床和实践等方面的因素考虑在内，采取应对策略，从而使CAR-T技术能够成为可负担的治疗模式。

了解CAR-T细胞在实体瘤中失败的原因

递送不力

CAR T细胞研究和开发中需要回答的两个基本问题是，T细胞在静脉注射后会去哪里，以及是它们进入肿瘤的有效性。

模型的临床前数据表明，很少有注射的CAR-T细胞最初进入肿瘤，注射到同基因小鼠体内的小鼠T细胞只持续几周。人体的临床试验数据表明，CAR-T细胞最初在肺部和次级淋巴器官中积累，然后在接下来的24-48小时内非常低效地转移到肿瘤中。

CAR-T细胞进入肿瘤首先需要识别内皮细胞表面分泌并结合的趋化因子，内皮细胞主要位于肿瘤间质中，而不是肿瘤细胞富集区。这种最初的内皮识别之后是由选择素介导的滚动粘附，然后是整合素的牢固粘附。在趋化因子（特别是CXCL9、CXCL10、CXCL11以及CCL5）的驱动下，T细胞然后迁移到肿瘤基质中。在这里，血管周围细胞、细胞外基质蛋白和间充质基质细胞（主要是成纤维细胞）组成了屏障。一些T细胞通过间质迁移，更少的T细胞最终在肿瘤衍生趋化因子的引导下进入肿瘤细胞富集区，在那里它们可以杀死肿瘤细胞，这一过程需要与肿瘤细胞上的ICAM1结合。这一过程效率极低，导致很少的T细胞成功地与肿瘤细胞相互作用。这里存在许多缺乏效率的原因，包括趋化因子-CCR失配、粘附受体缺陷和充当屏障的细胞外基质。

另一个重要但被低估的问题可能是CAR-T细胞向淋巴组织和远离实体瘤的“误导”。到目前为止，CAR T细胞的制造主要受到在B细胞白血病或淋巴瘤患者中测试CD19靶向产品的试验产生的数据指导，这些试验强调了淋巴结和/或骨髓运输、抗肿瘤活性的扩展和持久性的重要性。已知具有高水平CCR7和CD62L表达的T细胞优先运输到淋巴结或骨髓。因此，大多数当前方案的目标是产生主要具有中枢记忆细胞（CD62L高和CCR7高CD45RO+）表型的CAR-T细胞，而不是效应记忆细胞（CD 62L低和CCR7-低CD45RO++）表型，这通常不利于向肿瘤的转移。

此外，应考虑另外两个注意事项。首先，冷冻保存可能会影响CD62L的表达，从而影响运输。其次，CD62L被认为通过其他机制促进抗肿瘤活性，具体而言，CD62L可能引导T细胞向某些实体瘤中存在的三级淋巴结构内的高内皮细胞微静脉运输。这些淋巴结构可能促进T细胞浸润，并改善抗肿瘤免疫反应。

短持久性

在涉及实体瘤患者的临床试验中，就CAR-T细胞的持久性而言，使用PCR或流式细胞术检测，迄今为止进行的几乎每一项试验都显示CAR-T细胞仅存在于血液样本中。血液中CAR T细胞DNA转录物的范围为每微克DNA10³至10⁴个拷贝，输注后仅在约一个月内检测到CAR-T细胞，峰值通常出现在10-14天。相比之下，在白血病患者中测试CD19靶向CAR-T细胞的大多数成功试验都发现，血液中有大量的CAR-T细胞，通常为每微克DNA 10⁵-10⁶个拷贝，其持续时间从几个月到几年不等。

总之，临床前和临床研究的结果表明，静脉注射后，CAR-T细胞向肿瘤的转运效率非常低，而且大多数这种转运可能在注射后不久发生。从人类研究中获得的有限数据表明，进入实体瘤的少数CAR-T细胞具有有限的持久性，并且不会广泛增殖。

效应器功能丧失

CAR-T细胞的临床前研究一致发现，它们的细胞毒性活性最初很高，但随着时间的推移逐渐降低。基因组和表观基因组的变化都与这种低功能状态有关。诱发这种进行性功能减退状态的原因尚不完全清楚。可能与TME中存在的多种因素相关，包括低pH、缺氧、由于关键氨基酸和葡萄糖水平低而导致的营养缺乏、高水平的活性氧（ROS）、免疫抑制介质（如TGF-β、PGE2、腺苷和IL-10）的存在，以及与骨髓来源的抑制细胞和CD4+调节性T细胞的相互作用。T细胞内在因素包括由免疫检查点（如PD-1、CTLA4、TIM3、TIGIT和LAG3）和抑制性细胞内信号通路（如DGK、NR4A、SHP1和cbl-b）介导的“调节性关闭”。此外，还有多种表观遗传学变化。

肿瘤异质性与抗原扩散

与B细胞恶性肿瘤或多发性骨髓瘤不同，实体瘤中的抗原表达几乎总是较低且更异质。因此，除非CAR-T细胞诱导某种旁观者或抗原扩散效应，或靶向多种抗原，否则成功治疗的可能性很低。

我们可以汲取的经验教训

某些实体瘤患者现在可以使用过继性T细胞转移成功治疗，其中最显著的成功是黑色素瘤患者的TIL治疗。在非小细胞肺癌患者中使用TIL也取得了有希望的结果。我们可以从这些成功中学到什么，以使CAR-T细胞在实体瘤中取得更大的成功？

针对淋巴结转移优化的T细胞可能不是针对实体瘤的最佳细胞

与优先运输至外周位点的效应细胞或效应记忆细胞相比，CD62L和CCR7在幼稚或中央记忆T细胞上的高表达能够优先运输至次级淋巴结和骨髓。当用于开发靶向实体瘤的CAR-T细胞时，这些表型的细胞可能是次优的。实体瘤导向的CAR-T细胞被设计为靶向在实体瘤细胞表面表达的完整抗原。因此，当这些细胞进入骨髓或淋巴结时，它们将不会遇到它们的抗原，因此不会被激活以增殖或分化为效应细胞，除非肿瘤已经转移到这些位置。数据显示，在实体瘤模型中，效应器CAR-T细胞比记忆T细胞更有效。因此，使用旨在优化淋巴结运输的标准方案产生CAR-T细胞可能是实体瘤需要避免的一个关键教训。

DC交互可能很重要

TIL或TCR-T细胞和CAR T细胞之间的一个重要区别是前者可以被DC广泛激活，DC可以提供最佳的共刺激信号。这种共刺激可以发生在淋巴结和骨髓中。找到利用DC激活能力的方法，以增强CAR-T细胞增殖和持续的能力，是我们应该尝试从涉及TIL的试验中吸取的经验。

可能不需要长期持久性

普遍认为，CAR-T细胞的成功与CAR-T细胞的持久性密切相关。然而，由于多种原因，在实体瘤患者中测试CAR-T细胞的临床试验中，持久性的重要性尚未得到证实。此外，来自实体瘤模型的数据表明，CAR-T细胞的持久性与T细胞功能低下水平的增加有关。

解决这一难题的方法如修饰CAR-T细胞，使其更持久，更不易发生功能低下。过去几年，使用这种方法在实体瘤患者中取得了一些令人鼓舞的成功。然而，另一种需要考虑的方法是不考虑持久性，而是使用多次给药策略给予新鲜的CAR-T细胞。随着时间的推移，注射的CAR-T细胞会耗尽，它们可以被新剂量的高活性CAR-T细胞取代。这种方法减少CAR成分的免疫原性是必要的，以避免多次给药的细胞被排斥。

靶向多种肿瘤抗原很重要

除了激活机制的差异外，TIL和CAR-T细胞之间的一个重要差异是，前者本质上是多克隆的，因此可能靶向不止一种抗原。任何成功治疗实体瘤患者的CAR-T细胞疗法都需要靶向多个肿瘤特异性靶点，最佳地触发某种旁观者效应或诱导抗原扩散到内源性免疫系统。例如，通过设计分泌FLT3配体的CAR-T细胞对DC的募集，以及使用4-1BB激动剂的DC激活，以促进内源性T细胞反应和抗肿瘤活性增强。

如何更好地开发CAR-T

为了应对这些挑战，可以考虑通过优化两种不同的策略来向前迈进，以在实体瘤患者中取得更大的成功。策略1是该领域的当前方向，基于为血液系统恶性肿瘤患者开发的传统“记忆细胞”模式。策略2采用不同的“短命效应细胞”模式。

策略1：记忆细胞模式

这种方法的目标是最大限度地提高CAR-T细胞的运输和持久性，同时最大限度地降低CAR T功能低下的程度。作为策略的一部分，大剂量化疗的淋巴结清除用于增强植入。CAR-T细胞的持久性和低功能已经通过向T细胞引入特定的遗传改变（如通过CRISPR）来抑制可能的抑制因子来解决，允许T细胞“休息”，从而防止慢性刺激，或直接通过使用能够分泌细胞因子或其他蛋白质的武装CAR-T细胞来改变TME。

与该策略相关的一个主要挑战是需要引入多种基因改变。在过去的几年里，许多研究已经能够使用标准的CRISPR技术敲除一个或多个基因，并且开发了许多更先进的CRISPR技术，能够以非常低的脱靶突变率进行高效的基因编辑。

衍生自诱导多能干细胞（iPSC）的异基因T细胞的开发也可以提供一种替代方法，通过允许进行多种遗传改变来改善CAR-T细胞的运输和持久性。iPSC将首先使用各种CRISPR引导物进行修饰，从而能够敲低选定的基因，使细胞具有低免疫原性，然后使用能够敲低T细胞功能的选定关键抑制剂的引导物。在选择具有所有预期改变的克隆后，可以添加额外的基因来增强运输或功能。

策略2：短命效应细胞模式

尽管没有得到很好的研究，但一些数据支持在实体瘤小鼠模型中使用寿命更短、更像效应器T细胞的优越性。例如在对间皮素靶向CAR-T细胞的研究中发现，具有CD28–CD3ζ胞内结构域（更像效应器）的细胞比具有4-1BB–CD3z胞内结构域的细胞具有更好的抗肿瘤活性。

鉴于持久性不是目标，策略2也可能使用mRNA转导的CAR T细胞。这种方法的一个明显优点是对转基因的大小没有限制，可以通过电穿孔引入一种以上的mRNA并同时表达，从而能够引入多种遗传变异。

然而，使用这种方法制备的mRNA–CAR-T细胞的一个潜在限制是，与策略1中的“一次性”方法相比，必须随时间给药多剂量CAR-T细胞的成本问题。尽管患者需要再次输注，但这与化疗或免疫检查点抑制剂的给药类似，通常每4-6周给药一次，有时会持续多年。

小结

解决CAR-T细胞疗法在实体瘤患者中的应用所面临的众多挑战是一项艰巨的任务。目前的治疗方法对实体瘤患者基本无效，其中的原因我们并没有完全理解。获得更多更好的关于CAR-T细胞在接受治疗的患者中的运输、持久性和功能的信息对于解决这些方面的问题至关重要。

治疗成功的大量障碍可能需要多种免疫逃避机制的共同靶向。这些策略将包括使用CAR工程的优化，在离体T细胞扩增过程中优化条件以促进特定T细胞亚型的出现，以及操纵宿主以改变TME或刺激天然T细胞，可能需要使用所有这些方法来实现最佳结果。

参考文献：

1.CAR T cell therapy for patients with solid tumours: key lessons to learn and unlearn. Nat Rev Clin Oncol.2023 Oct 30