铁死亡是一种由铁代谢紊乱引起的细胞死亡形式，在多种疾病中扮演重要角色，其发生与组织修复中铁代谢的调节密切相关。在对退变椎间盘组织的分析中，发现细胞外铁离子（ex-iron）浓度与椎间盘退变（IVDD）中铁死亡的严重程度呈正相关。受磁铁吸引金属原理的启发，苏州大学附属第一医院陈亮/顾勇/郗焜/Yu Feng将聚醚F127二丙烯酸酯（FDA）与单宁（TA）结合，构建了一种新型的磁力吸引水凝胶（FDA-TA）。这种水凝胶不仅能有效吸附ex-iron并重塑细胞铁代谢，而且具有良好的韧性和自修复能力。尤为重要的是，它能够激活PI3K-AKT信号通路，抑制在ex-iron富集条件下由核受体共激活因子4介导的铁蛋白自噬（ferritinophagy）。这些治疗效果和相关机制已在体内得到进一步的证实。因此，基于病理机制，设计了一种针对性的水凝胶重塑铁代谢，为组织修复提供了新的见解。该研究以题为“Magnetically attracting hydrogel reshapes iron metabolism for tissue repair”的论文发表在《Science Advances》上。

图1展示了磁性吸附水凝胶的制备过程以及其在治疗椎间盘退变（IVDD）中铁代谢重塑中的作用机制。通过结合聚醚F127二丙烯酸酯（FDA）和单宁（TA），构建了一种能够磁力吸引并吸附细胞外铁离子（ex-iron）的水凝胶（FDA-TA）。该水凝胶不仅能有效吸收退变椎间盘组织中的ex-iron，而且通过激活PI3K-AKT信号通路，抑制核受体共激活因子4（NCOA4）介导的铁蛋白自噬，从而维持细胞内的铁离子稳态。

图 1.制备磁性吸收水凝胶及重塑治疗IVDD中铁代谢的示意图

【在人类退变NP组织中验证铁离子浓度、铁死亡和退变程度之间的关系】

图2验证了在人类退变椎间盘核心（NP）组织中，铁离子浓度、铁死亡程度与退变严重性之间的相关性。通过术前磁共振成像（MRI）检查，根据Pfirrmann分级，将患者分为中度和重度退变两组。收集手术中移除的NP组织，进行普鲁士蓝染色，结果显示重度退变组织中的铁离子沉积显著多于中度退变组织。此外，铁死亡的关键抑制蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）和铁蛋白重链1（FTH1）的表达，在重度退变组织中显著降低，与组织退变程度呈负相关。这表明随着NP组织的退变，细胞外铁离子浓度显著增加，诱发了椎间盘核心细胞（NPCs）的铁死亡。因此，人类NP组织中铁离子浓度的增加与组织退变严重性正相关，且与铁死亡的发生有关。

图 2.在人类退变NP组织中验证铁离子浓度、铁死亡和退变程度之间的关系

【在大鼠退变NP组织中验证铁离子浓度、铁死亡和退变程度之间的关系】

图3通过不同程度地穿刺大鼠尾椎，建立了不同程度的椎间盘退变模型，并通过MRI观察了T2加权像信号强度的变化，即“黑色椎间盘”信号的逐渐减弱。实验结果显示，随着退变程度的增加，GPX4和FTH1的表达逐渐降低，普鲁士蓝增强染色显示严重退变组的NP组织中铁离子浓度显著增加。此外，透射电子显微镜观察到，与对照组相比，TBHP和Fe³⁺组的线粒体形态显著密集，嵴消失或结构破裂。这些结果表明，高浓度的细胞外铁离子会导致线粒体功能障碍和细胞内铁离子超载，从而诱导铁死亡，并且这种效应在体外实验中得到了体现。因此，大鼠NP组织中铁离子浓度的增加与椎间盘退变程度正相关，并且铁离子诱导的铁死亡可能对NP细胞的结构和功能产生影响。

图3. 在大鼠退变NP组织中验证铁离子浓度、铁死亡和退变程度之间的关系

【铁离子诱导的NPCs铁死亡的体外验证】

图4展示了体外实验中，铁离子通过诱导铁死亡对椎间盘核心细胞（NPCs）的影响。实验中使用了100 μM的氯化铁溶液（Fe³⁺）和作为阳性对照的100 μM叔丁基氢过氧化物（TBHP）来刺激NPCs。结果显示，Fe³⁺和TBHP组的细胞增殖显著受到抑制，并且细胞形态与对照组不同。Western blot分析显示，Fe³⁺和TBHP组中GPX4和FTH1的表达显著低于对照组，免疫荧光结果也一致。此外，Fe³⁺处理后，TFR1蛋白表达增加，这与细胞内铁离子浓度的增加有关。DMT1和FPN的表达也受到铁离子浓度的影响。使用FerroOrange探针测量的细胞内Fe²⁺浓度在Fe³⁺和TBHP组显著增加。透射电子显微镜观察到，Fe³⁺组线粒体膜破裂，失去了正常结构，而TBHP组线粒体密度增加，嵴消失。JC-1染色检测线粒体膜电位显示，Fe³⁺和TBHP组的绿色荧光强度显著增强，表明线粒体膜电位降低，功能异常。此外，Fe³⁺和TBHP组的ROS产生和脂质过氧化显著高于对照组。划痕实验表明，Fe³⁺和TBHP组的NPCs迁移性能差，细胞活性显著降低。因此，高浓度的细胞外铁离子可以诱导NPCs的铁死亡，影响其活性和功能，而TBHP则通过增加细胞内ROS和触发脂质过氧化来诱导铁死亡，其机制与Fe³⁺不同。

图 4.铁离子诱导的NPCs铁死亡的体外验证

【靶向磁性吸收水凝胶的制备和特性】

图5通过不同的体积比例（2:1, 3:1, 和 4:1）混合聚醚F127二丙烯酸酯（FDA）和单宁（TA），制备了具有不同孔径和机械强度的水凝胶。扫描电子显微镜（SEM）分析显示，这些水凝胶具有相对均匀的孔结构，且随着TA含量的减少，孔径变小。通过铁离子吸附测试，发现含有较高TA的水凝胶（G2组）具有最强的铁离子吸附能力。此外，通过流变学测试，FDA-TA水凝胶展现出良好的自修复性能和韧性。生物相容性实验表明，靶向水凝胶对大鼠椎间盘核心细胞（NPCs）的活性没有负面影响，且在体外培养中细胞能够持续增殖。这些结果表明成功制备了具有理想机械性能、良好生物相容性和铁离子吸附能力的靶向磁性水凝胶，为后续的体外和体内实验提供了一个有前景的治疗IVDD的平台。

图5. 靶向磁性吸收水凝胶的制备和特性

【靶向水凝胶体外重塑铁代谢】

图6展示了靶向水凝胶在体外重塑铁代谢并抑制椎间盘核心细胞（NPCs）铁死亡的效果。实验中，通过与NPCs共培养，靶向水凝胶（FDA-TA）显示出能够减少由氯化铁溶液诱导的铁离子积累，并通过激活PI3K-AKT信号通路抑制NCOA4介导的铁蛋白自噬。Western blot和免疫荧光分析表明，与对照组相比，经靶向水凝胶处理的细胞中GPX4、FTH1、FPN等铁死亡相关蛋白的表达得到恢复，同时铁离子转运蛋白如DMT1和TFR1的表达降低。此外，铁离子浓度的测定、线粒体形态的观察、ROS的产生和脂质过氧化的检测均表明，靶向水凝胶能有效减轻铁离子诱导的氧化应激和细胞损伤。因此，靶向水凝胶通过调节铁代谢和抑制铁蛋白自噬，有效抑制了体外模型中NPCs的铁死亡，维持了细胞的正常生理功能。

图6. 靶向水凝胶体外重塑铁代谢

【靶向水凝胶激活PI3K-AKT途径抑制NPCs中铁蛋白自噬】

图7通过转录组测序分析，研究者发现在经靶向水凝胶处理的细胞中，PI3K-AKT信号通路显著上调，而铁死亡和自噬相关生物过程则被下调。基因集富集分析（GSEA）和基因本体（GO）分析也支持了KEGG分析的结果，显示了细胞生物学行为的变化。此外，通过对人类和大鼠退变NP组织以及体外培养的NPCs进行的Western blot和免疫荧光分析，研究者观察到，在铁离子诱导的条件下，NCOA4介导的铁蛋白自噬相关蛋白LC3b和NCOA4的表达上调，而PI3K-AKT信号通路的活化则在靶向水凝胶处理的细胞中被观察到。这些结果表明，靶向水凝胶可能通过激活PI3K-AKT信号通路来抑制铁蛋白自噬，进而抑制铁死亡。因此，靶向水凝胶通过调节PI3K-AKT信号通路，有效抑制了由铁离子超载引起的NCOA4介导的铁蛋白自噬，从而对NPCs的铁死亡起到了抑制作用。

图7. 靶向水凝胶激活PI3K-AKT途径抑制NPCs中铁蛋白自噬

【靶向水凝胶在体内抑制铁蛋白自噬，抑制铁死亡，并治疗大鼠IVDD】

图8通过在大鼠尾部脊椎进行穿刺建立IVDD模型，然后注射不同溶液进行治疗，包括氯化铁溶液、F127-DA、去铁霉素（DFO）和F127DA-TA溶液。通过放射学和磁共振成像（MRI）检测了治疗后的椎间盘高度和信号强度变化，并计算了椎间盘高度指数（DHI%）。组织学评估包括H&E染色和Safranin-O染色，以观察NP组织的体积和椎间盘的结构界限。此外，通过普鲁士蓝增强染色、免疫组织化学和免疫荧光染色观察了铁离子浓度、铁蛋白自噬和相关信号通路的变化。结果显示，靶向水凝胶（FDA-TA）在减缓椎间盘高度下降、保持椎间盘信号强度、增加NP体积和清晰界限方面表现优于其他实验组。普鲁士蓝染色结果表明FDA-TA组的铁离子浓度显著降低，与对照组相似，显示出优秀的铁离子螯合能力。免疫组织化学结果表明，与DFO和FDA-TA组相比，Fe3+和FDA组中涉及铁蛋白自噬的LC3b和NCOA4阳性细胞数量显著更高，表明DFO和FDA-TA组中NCOA4介导的自噬过程受到抑制。Western blot分析也证实了治疗后相关蛋白表达的变化。因此，靶向水凝胶在体内通过减弱铁蛋白自噬、抑制铁死亡，并对IVDD进行治疗，展现了良好的疗效和治疗潜力。

图8. 靶向水凝胶在体内抑制铁蛋白自噬，抑制铁死亡，并治疗大鼠IVDD

【小结】

该研究发现在椎间盘退变（IVDD）的退变细胞外基质中，细胞外铁离子（ex-iron）浓度显著增加，并且与退变程度呈正相关。为了应对这一问题，设计了一种聚醚F127二丙烯酸酯（FDA）与单宁（TA）结合的磁性吸引水凝胶（FDA-TA），该水凝胶能够靶向吸附ex-iron，重塑铁代谢，并在体外实验中显著清除由积累的ex-iron引起的活性氧（ROS）和铁代谢紊乱。转录组测序揭示了靶向水凝胶通过激活PI3K-AKT信号通路，抑制NCOA4介导的铁蛋白自噬。体内实验进一步证实了靶向水凝胶的治疗效果和作用机制，表明其能够减弱铁蛋白自噬，抑制铁死亡，并在大鼠IVDD模型中展现了治疗效果。总体而言，这项研究基于IVDD的病理生理变化，开发了一种靶向ex-iron的磁性水凝胶，以重塑铁代谢，为组织修复提供了一种有前景的临床解决方案。

原文链接：

https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.ado7249