全球范围内，血栓栓塞性疾病的死亡率大约为25%。相较于动脉血栓形成，如心脏病和中风等，公众对静脉血栓栓塞（包括肺栓塞和深静脉血栓形成）的认知程度普遍较低。目前，血小板血栓抑制剂主要涉及抑制血小板的活化与聚集、调节凝血级联反应，并将纤溶剂与其他成分结合的化合物。对新型血小板血栓抑制剂的持续需求，源于对出血风险、潜在药物相互作用以及与众多现有药物相关的耐药性问题的顾虑。

有证据表明，依赖于血管性血友病因子（VWF）的血小板活化在血栓性综合征的发展过程中扮演了关键角色。实际上，有研究显示，破坏胶原蛋白与vwfegPIb/V/IX相互作用，是一种前景广阔的抗血栓治疗手段，其安全性可能优于阻断血小板聚集。在动物模型中，单克隆抗体及其他干扰VWFeGPIb轴的化合物已展现出显著的抗血栓形成潜力。这些研究验证了预期的抗血栓效果，具备了广泛的治疗范围。然而，其发展面临的主要障碍在于这些化合物无法通过口服给药。

中医药广泛应用于促进血液循环、消散血瘀、缓解肿胀、减轻疼痛等领域。众多研究机构，例如对丹参和人参的研究，正致力于改善血液循环紊乱以及预防和治疗血栓。结果显示，中医药能够阻止血小板聚集，抑制凝血级联反应，抑制炎症反应，并防止单核细胞的侵袭，从而阐释了其作用机理。

日前，一篇名为“Ginsenoside CK targets PHD2 to prevent platelet adhesion and enhance blood circulation by modifying the three-dimensional arrangement of collagen”的文章探究了中药人参提取物皂苷CK如何增强血流动力学循环，缓解血瘀的相关作用机制。

图1 论文首页

CK改善大鼠急性软组织损伤

为深入研究CK的作用机制，研究构建了大鼠急性软组织损伤模型（图2A）。在该模型中，以局部缺氧为特征，选用具有多功能抗氧化作用的乙酰半胱氨酸（NAC）作为阳性对照。所描述的流程进行药物施用与治疗。结果表明，与对照组相比，mod组的肿胀程度显著加剧，而CK（12.5和25mg/kg）治疗则有效减轻了组织水肿（图2B）。此外，受伤部位的综合评分亦显示CK显著改善了组织损伤状况（图2C）。随后，通过HE和Masson染色法对受伤软组织切片进行了观察（图2D、E）。

与mod组相比，CK和NAC组的胶原纤维增殖、肌纤维排列紊乱或坏死以及出血和严重血瘀症状均有所减轻。软组织损伤引发血管活性物质、前列腺素及其他炎症介质在损伤部位的积聚，进而加剧微循环障碍。结果（图2F-I）显示，在不同剪切条件下，全血粘度显著上升。然而，NAC和CK处理均表现出不同程度的改善效果。如预期所示，mod组的血浆红细胞（RBC）计数、白细胞（WBC）计数、淋巴细胞（LYMPH）和中性粒细胞（NEUT）显著升高（图2J-M），这表明存在炎症反应和组织损伤。这些细胞计数在干预后显示出不同程度的下降。综上所述，CK显著改善了大鼠血液循环障碍，并减轻了由软组织损伤引起的炎症损伤。

图2 CK改善大鼠急性软组织损伤

CK影响HIF-1信号通路

研究筛选后共识别出22种具有显著差异的代谢物，并通过热图进行了聚类分析（图3A）；同时，基于KEGG代谢途径分析了这些代谢物的功能及其富集程度。结果显示，CK主要影响HIF-1信号通路、胆碱代谢、以及牛磺酸和次牛磺酸代谢（图3B）。在缺氧条件下，CK干预后揭示了α-酮戊二酸（2-OG）和维生素C（Vc）两种显著的差异代谢物（图3C）与PHD2在调节HIF-1α的羟基化修饰方面存在复杂的相互作用。

缺氧条件下，HIF-1α能够避免泛素化和降解，进而激活其进入细胞核并启动包括VEGF在内的基因转录表达。通过靶向抑制PHD2，可以促进HIF-1α的活化并增加VEGF的表达（图3D）。随后，研究对受损软组织中HIF-1信号通路关键蛋白的表达进行了评估。PHD2蛋白的表达并未受到CK的影响；然而，在CK处理组中，HIF-1α及其下游蛋白标志物VEGF的表达有所增加。这些数据表明，在软组织损伤的情境下，CK与HIF-1信号通路在抑制PHD2功能方面可能存在潜在的关联性（图3E）。

图3 大鼠软组织损伤的非靶向血浆代谢组学分析与评价

CK通过破坏VWF和胶原蛋白之间的结合来减少血小板粘附

随即，研究评估了CK对血小板与胶原蛋白粘附性的影响。结果表明，在PHD2与胶原蛋白发生相互作用后，大量血小板粘附于基质，并在微孔板上形成聚集体（图4A）。然而，使用CK或PHD2抑制剂IOX2处理后，血小板在胶原蛋白上的扩散和血小板间的相互作用明显受损。

血小板上的GPIb-IX-V复合物在VWF因子存在的情况下粘附于胶原纤维，构成了血小板粘附于胶原表面的主要机制。这一过程与PHD2介导的胶原蛋白羟基化存在复杂的联系（图4B）。为阐明CK在血小板与胶原蛋白粘附中的关键作用，研究进行了VWF与涂有微孔板的胶原蛋白之间的相互作用试验。CK对血小板粘附的抑制作用通过荧光指示抗体检测胶原结合的血小板（图4C）和胶原结合的VWF（图4D）得到证实。结果表明，PHD2介导的胶原羟基化增强了结合亲和力，而CK处理破坏了VWF和胶原之间的相互作用，从而减弱了血小板对胶原的粘附（图4E）。

此外，研究进一步采用MST技术来评估VWF和胶原蛋白之间的粘附强度。很明显，VWF与胶原蛋白的直接结合强度最小（图4F）。然而，当用PHD2修饰时，脯氨酸羟基化胶原蛋白对VWF具有很强的亲和力，KD=94.1 nmol/L（图4G）。相反，CK将这些实体之间的粘附力显著降低了近十倍，KD=865.6 nmol/L（图4H）。这证实了CK有效地阻碍了VWF和胶原蛋白之间的相互作用，最终阻碍了血小板粘附。

图4 CK降低血小板粘附，破坏VWF和胶原蛋白之间的结合

CK通过抑制血小板粘附缓解小鼠DIC

为深入探究靶向PHD2在血小板血栓形成过程中的核心作用，研究采用LPS诱导的小鼠DIC模型，以评估肺组织中尾部出血及血栓形成情况。各实验组小鼠尾部出血情况的调查结果显示，mod组由于严重的DIC导致的出血显著减少（图5A）。然而，应用ASP和不同剂量的CK（10、20和40mg/kg）均能改善出血状况，并进一步通过量化出血时间和出血量提供了支持性证据（图5B、C）。

肺组织的Masson染色（图5D）和HE染色（图5E）结果揭示了不同处理组血栓形成程度的差异。凝血酶活性是血栓形成的关键指标，CK干预后，凝血酶活性呈现剂量依赖性的提升（图5F），同时纤维蛋白原向纤维蛋白的转化过程也得到加强（图5G）。此外，VWF胶原定位评估表明，mod组肺组织内血栓位置存在显著的重叠现象。然而，CK的使用成功破坏了VWF与胶原的定位关系，减少了血栓的形成（图5H）。结果表明，CK能够预防VWF与胶原的相互作用，降低血小板粘附，从而阻碍血小板血栓形成的起始阶段。

图5 CK在小鼠DIC模型中抑制肺血栓

结论

研究表明，通过靶向抑制PHD2以降低胶原蛋白的羟基化作用，并继而阻断VWF与胶原蛋白的结合，这一策略展现出作为创新抗血小板治疗的潜力，有望有效预防病理性血栓的形成，并改善血液循环系统疾病。

参考文献：

Chuanjing Cheng, Kaixin Liu, Jinling Zhang, Yanqi Han,Tiejun Zhang, Yuanyuan Hou, Gang Bai.Ginsenoside CK targets PHD2 to prevent platelet adhesion and enhance blood circulation by modifying the three-dimensional arrangement of collagen.Acta Pharmaceutica Sinica B.Available online 31 December 2024