近年来，2型糖尿病患者的日益增加，导致终末期肾病的负担增加。鉴于糖尿病肾病的可预防性，因此通过识别有糖尿病肾病进展风险的患者，有助于实现进行相关疾病的早期强化干预。虽然全基因组关联研究在识别2型糖尿病和其他复杂疾病的遗传标志物方面取得了相当大的成功，但在识别与糖尿病肾病相关的基因位点方面的进展却差强人意。有研究表明，表观遗传标志物（包括甲基化变化和miRNA）可能能够捕捉环境因素和基因组之间的相互作用，并可能为糖尿病相关并发症提供新的生物标志物。特别是甲基化，已经被假定为糖尿病并发症的有潜力的生物标志物。

近期，来自香港中文大学的研究团队及合作者在Nature Communications发表了题为“DNA methylation markers for kidney function and progression of diabetic kidney disease”的研究文章。研究团队在1271名2型糖尿病受试者中进行了两项独立的表观基因组关联研究，分析了外周血中CpG位点的甲基化是否与肾功能有关，鉴定出与基线估计肾小球滤过率（eGFR）和随后的肾功能下降（eGFR斜率）相关的甲基化标志物。同时，研究人员还开发了一种多位点分析方法，并在一个独立的2型糖尿病原住民队列中进行了验证。

文章发表在Nature Communications

研究人员使用来自香港糖尿病登记中心的前瞻性队列，包含1271名2型糖尿病患者，进行了两项独立的全表观基因组关联研究，检测了患者全血样本的DNA甲基化。对于产生的DNA甲基化数据，在过滤和标准化后，最终保留了434,908个CpG位点和1268个样本，并发现全基因组DNA甲基化趋势与肾功能相关。 

为鉴定与肾功能相关的单个CpG位点，研究人员进行了一项关于基线eGFR的表观基因组关联分析（EWAS），将性别、年龄、吸烟状况、糖尿病持续时间等作为协变量。对于基线eGFR，有40个CpG位点达到表观基因组全显著性，386个CpG点在FDR=0.05时具有统计学意义。对于eGFR斜率，8个CpG位点为表观基因组显著，74个CpG位置在FDR= 0.05时显著 （图1）。表明单个CpG位点的甲基化水平与基线肾功能和肾功能下降有关。

图1. CpG甲基化与肾功能之间的关系

上述研究数据是基于识别CpG位点的单位点方法，存在一定的局限性。为此，研究团队开发了识别指示肾功能的CpG位点组的多位点方法，可同时考虑所有CpG站点，并选择其中的一个子集来创建推断基线eGFR或eGFR斜率的最佳模型。 

在“最终”模型中，分别包括64和37个CpG位点用于预测基线eGFR和eGFR斜率。对于基线eGFR和eGFR斜率，实际值和最终模型推断值的Pearson相关系数分别为0.806和0.635（图2a、b），有协变量的模型性能优于没有协变量的模型（图2c、d），并且它们明显优于由相同数量的随机CpG位点构建的模型和几个备选模型。 

为了评估所选择位点能否成功地对患有或未患有肾脏疾病的个体进行分类，研究团队使用上述选择的CpG位点构建了一个逻辑回归模型。结果显示，所有模型在分析中表现良好，基线eGFR的平均AUROC为0.89，eGFR斜率为0.81，证明了这些模型识别潜在肾功能障碍患者的能力。

随后，研究人员利用326名美国2型糖尿病患者对上述模型进行了性能测试，同样对血液样本进行全基因组甲基化测序。结果表明，模型在独立队列中预测2型糖尿病的基线eGFR和eGFR下降方面也表现出良好的性能。（图2e-h）

图2. 多位点模型的性能

研究人员还评估了单位点和多位点分析中确定的CpG位点附近（1kb以内）基因的功能意义。数据显示，与基线eGFR相关、且靠近（在1kb以内）注释基因的348个CpG位点（对应358个基因）中，有228个（对应215个基因）（65.5%）在至少一项已有研究中被报道。对于eGFR斜率，76个CpG位点中有51个（67.1%）（对应89个基因中的52个)被报道可能与肾功能相关。

现有的风险方程使用的是临床变量来预测肾脏相关结果。这个研究开发的eGFR斜率多位点模型是否也可以预测未来的终末期肾病病例呢？当将所有患者纳入考虑时，协变量多位点模型实现了0.94的AUROC，0.73的AUPR（精确召回曲线下面积）（图3）。当排除基线eGFR<30ml/min/1.73m2且5年内发生终末期肾病风险非常高的患者时，协变量模型实现了0.88的AUROC，0.36的AUPR（图3）。在这两种情况下，即使没有临床协变量，模型性能也与临床方程的性能相当，并且纳入临床协变量进一步增强了模型的性能。简言之，多位点模型推断的eGFR斜率可以预测未来的肾衰竭。

图3. 风险方程和多位点模型的风险评分表现

综上所述，研究团队完成了来自2型糖尿病患者队列的甲基化谱研究，研究结果强调了利用血液样本中的甲基化水平来预测eGFR或不同人群中eGFR变化的潜在效用。研究还发现了此前未发现的与肾功能、肾功能下降和肾脏病理相关的甲基化标志物，强调了在2型糖尿病患者中使用甲基化标志物进行肾脏疾病风险分层的潜力。

参考资料：

Li, K.Y., Tam, C.H.T., Liu, H. et al. DNA methylation markers for kidney function and progression of diabetic kidney disease. Nat Commun 14, 2543(2023). 

https://doi.org/10.1038/s41467-023-37837-7