动脉粥样硬化(AS)是冠状动脉疾病、外周动脉疾病和脑血管疾病最常见的基础病理，斑块在血管中的慢性积聚导致明显的狭窄，从而限制血液流动并导致严重的组织缺氧和炎症。我国动脉粥样硬化的发病率逐年上升，动脉粥样硬化治疗的新靶标、新机制和药物仍然是研究的重点。

2023年11月30日，中国药科大学胡庆华教授团队在European Heart Journal发表了题为“Macrophage P2Y₆ receptor deletion attenuates atherosclerosis by limiting foam cell formation through phospholipase C_β/store-operated calcium entry/calreticulin/scavenger receptor A pathways”的研究论文，首次揭示了嘌呤受体P2Y₆R调控巨噬细胞泡沫化进而参与动脉粥样硬化发生发展的作用和分子机制，筛选并确证维生素B1的辅酶形式焦磷酸硫胺素(TPP)具有优异的P2Y₆R抑制活性，超生理剂量的TPP可有效改善小鼠动脉粥样硬化，为动脉粥样硬化的治疗和预防提供了新策略。

首先，作者基于临床样本数据分析和动脉粥样硬化动物模型发现，P2Y₆R在动脉粥样硬化病程中高表达。为明确P2Y₆R在动脉粥样硬化病程中的作用，作者采用LDLR^-/-背景的P2Y₆R敲除小鼠(LDLR^-/-P2Y₆R^-/-)构建动脉粥样硬化模型，以LDLR^-/-敲除小鼠作为对照，发现P2Y₆R敲除可减少高脂饮食喂养的小鼠主动脉斑块产生。

随后，为进一步探究P2Y₆R发挥作用的主要细胞，作者分析了单细胞测序数据集GSE196395，结果显示15个细胞亚群中，巨噬细胞中P2Y₆R的表达最为显著。作者收集了动脉粥样硬化小鼠的斑块样本和临床患者的斑块样本，采用免疫荧光共定位进一步验证这一发现。巨噬细胞P2Y₆R特异性敲除小鼠(LDLR^-/-P2Y₆R^fl/flLysM^cre)构建的动脉粥样硬化模型也显示，巨噬细胞P2Y₆R的缺失可减少小鼠主动脉斑块的生成。

接下来，作者探究P2Y₆R调控巨噬细胞参与动脉粥样硬化的作用机制。巨噬细胞泡沫化是早期动脉粥样硬化形成的标志之一，作者先检测了P2Y₆R是否调控巨噬细胞的泡沫化，结果发现P2Y₆R缺失的巨噬细胞脂质摄取减少、抑制巨噬细胞泡沫化。清道夫受体是巨噬细胞表面的一类重要模式识别受体，参与调控脂质摄取和代谢等过程。通过筛选，作者发现P2Y₆R缺失可影响清道夫受体SR-A的表达，进而参与脂质摄取和巨噬细胞泡沫化。

进一步，作者探究P2Y₆R调控SR-A的深层分子机制。通过转录组学测序，作者发现P2Y₆R调控巨噬细胞的钙离子信号通路。细胞水平进一步揭示P2Y₆R缺失可降低巨噬细胞胞内钙离子水平，减少胞外钙离子内流。已有研究报道，P2Y6R与G_q蛋白偶联可激活磷脂酶C_β (PLC_β)信号传导及其下游钙信号传导，PLC_β可激活SOCE通路，SOCE的关键分子包括位于内质网膜上的STIMI和细胞膜上的ORAI1。因此，作者构建P2Y₆R沉默的细胞模型，研究P2Y₆R是否调控PLC_β/SOCE信号通路，结果发现P2Y₆R缺失影响PLC_β的表达、STIM1和ORAI1的共定位，抑制巨噬细胞泡沫化。作者进一步构建P2Y₆R过表达的细胞模型，结合PLC_β抑制剂U73122、Ca²⁺螯合剂BAPT-AM和SOCE抑制剂BTP2进一步探究，结果显示U73122、BAPT-AM和BTP2均能逆转P2Y₆R过表达引起的脂质摄取增多和巨噬细胞泡沫化增加。上述所有结果表明，P2Y₆R通过PLC_β/SOCE通路调控SR-A的表达参与调控巨噬细胞泡沫化。

为进一步探究PLC_β/SOCE下游调控SR-A的具体信号分子，作者采用蛋白组学测序检测与SR-A结合的蛋白。Calreticulin (CALR)引起了作者的关注，其参与脂质反应、内质网蛋白加工和清道夫受体的调控等过程，CO-IP和免疫荧光共定位实验证实了这一发现。至此，研究结果表明P2Y₆R通过PLC_β/SOCE/CALR通路调控SR-A的表达，参与巨噬细胞泡沫化。

循着这个思路，作者试图寻找可有效抑制P2Y₆R信号的小分子药物，探究其抗动脉粥样硬化的效果。通过高通量Glide分子对接筛选体系在药物库中寻找具有P2Y₆R抑制活性的药物，筛选发现焦磷酸硫胺素(TPP)、磷酸吡哆醛和沙丁胺醇三种小分子脱颖而出。其中，TPP表现出更好的抑制活性。TPP是维生素B1的辅酶形式，天然存在于米糠、胚芽、酵母及豆类等中，临床上用于维生素B1缺乏症的治疗。作者在细胞水平明确了TPP减少脂质摄取、抑制巨噬细胞泡沫化的作用，动物水平研究明确了大剂量TPP可减少动脉粥样硬化小鼠主动脉斑块的产生。利用P2Y₆R敲除小鼠，证实TPP依赖P2Y₆R发挥抗动脉粥样硬化的作用。此外，高剂量TPP未表现出显著的生理毒性，TPP治疗小鼠体重和摄食量与对照组无显著差异，心脏、肝脏、脾、肺和肾等器官未见损伤。

综上所述，本研究首次发现P2Y₆R参与动脉粥样硬化的深层机制，巨噬细胞P2Y₆R通过PLC_β/SOCE/CALR/SR-A信号通路调控巨噬细胞泡沫化。更重要的是，TPP作为一种新型P2Y₆R抑制剂被发现，超生理剂量的TPP可有效改善小鼠动脉粥样硬化，为动脉粥样硬化的治疗和预防提供了新策略。

本研究获得国家自然科学基金(NSFC81872867)和江苏省自然科学基金(BK20211223)的资助。中国药科大学药学院博士生李叶红、博士后周梦泽、苏州大学药学院李环球副教授为本论文的共同第一作者，中国药科大学生命科学与技术学院胡庆华教授为本文的独立通讯作者。

原文链接：

https://doi.org/10.1093/eurheartj/ehad796