具有成本效益和多重核酸检测对于实现各种疾病的分子诊断分析至关重要。新一代测序(NGS)因其准确性、基因组覆盖范围和成本下降而在病原体鉴定方面获得了研究兴趣。然而，传统的NGS检测涉及长时间和复杂的文库制备，不适合在门诊进行快速检测。

高度多重PCR平台，如BioFire FilmArray，已经在一些应用中得到采用。然而，与qPCR相比，这些仪器需要定制耗材、缺乏病原体DNA定量等原因，限制了它们的应用范围和对临床实践的影响。相比之下，定量PCR (qPCR)仪器系统广泛应用于世界各地的许多临床实验室和医院。标准qPCR仪器平台和检测具有有限的多路复用能力，只能使用4到6个荧光通道。研究人员一直致力于创造新的方法来增加qPCR的多样性。

近日，杂志Nucleic Acids Research上发表了一篇题为“Advancing quantitative PCR with color cycle multiplex amplification”的文章。作者提出了color cycle multiplex amplification (CCMA)方法，允许使用传统的qPCR仪器在单管反应中同时筛选许多不同的DNA目标。作者使用CCMA设计了一个用于检测21种败血症相关病原体DNA的大规模多重qPCR panel，应用于临床样品并将检测结果与“金标准”交叉验证。总体而言，两种方法的鉴定结果显示出相当好的一致性(85%)，临床灵敏度为89%，临床特异性为100%，显示了其作为分子诊断中高级定量筛选的强大工具的潜力。

图片来源：Nucleic Acids Research

主要内容

CCMA原理

在CCMA中，DNA靶标是根据荧光出现的顺序来识别的(图A)。荧光依次出现是通过使用寡核苷酸阻滞剂在qPCR Ct中合理设计延迟来实现的。随着所使用的荧光通道数量，以及可编程的Ct延迟的数量的增加，可以区分的目标数量呈指数增长(图C)。

CCMA的多重检测能力取决于稳定控制Ct的能力。作者使用合理设计的阻滞剂，减弱特定扩增子的PCR扩增，来调节不同荧光信号的Ct延迟。阻滞剂结合的DNA模板区域与反向PCR引物的区域重叠，导致竞争性杂交反应。通过无、弱、强阻滞剂的使用，或通过增加阻滞剂的化学计量，可以调整不同扩增子扩增的Ct，且仍然可以用于DNA定量目的。

颜色循环多重扩增（CCMA）的概念和目标识别能力。

图片来源：Nucleic Acids Research

21种病原体检测panel

使用CCMA设计一个用于检测21种败血症相关病原体DNA的大规模多重qPCR panel。首先选择能够唯一代表每个物种的特征区域，并分析了引物对应于panel中每个靶种的特异性。对于每个物种，从具有不同结合亲和力的候选阻滞剂中选择最佳分离时间的阻滞剂。然后用所有引物、选定的阻滞剂和TaqMan探针组合，对含有人类DNA背景的人造样品进行多重qPCR反应（如下图）。通过三个荧光曲线出现顺序来确定目标病原菌，以及获得目标的定量信息。在构建21种病原菌单链CCMA检测试剂盒的过程中，需要优化寡核苷酸浓度和热循环条件，以实现多重PCR反应。

基于CCMA的脓毒症相关细菌检测panel概述。

图片来源：Nucleic Acids Research

病原体多重检测panel的稳健性

21种细菌的CCMA试验，菌种输入量为5 ~ 1800拷贝时，相邻信号之间的ΔCt值差别不大（如图B），表明CCMA在不同模板数量下均实现了显著且稳定的时序判别。

作者下一步验证一个菌种下不同菌株之间的自然变异是否会对CCMA试验产生影响。结果显示，三种独特金黄色葡萄球菌菌株之间有着高度一致的ΔCt值（图D）。这验证了CCMA普遍识别目标物种的可靠性。

作者下一步验证在具有挑战性的样品条件，是否会影响CCMA测定。结果显示，在宿主DNA过量的情况下，以及在复杂基质中，如全血、PBMC、血浆、痰、口腔拭子和干血斑中，ΔCt值均保持稳定（图E）。

总之，这些结果有力地支持了CCMA检测对潜在的干扰宿主DNA和背景基质成分的稳健性，即使在不同的临床采样程序中，低病原体输入也能实现可靠的鉴定。

病原体多重检测panel的性能测试。

图片来源：Nucleic Acids Research

病原体多重检测panel的检测灵敏度和特异性

作者分别对21个菌种进行分析检出限(LoD)评估。结果显示，CCMA在所有物种中成功检测了30个拷贝。在21种细菌中，有12种(如单核增生李斯特菌)的LoD低至5拷贝（上图F）。且CCMA允许精确定量的DNA目标，校准曲线的测定系数范围为0.994 ~ 0.999（下图G），具有非常好的准确性和重复性。

双管策略检测多菌种同时存在的病例

当单个样品中存在多个靶点时，不同物种的相同颜色之间的干扰将显著影响物种鉴定和定量结果。采用双管策略的CCMA可以克服此限制。在总共20个物种中，使用CCMA可以成功地确定两个同时存在的物种，CCMA具有修改的色码，用于使用相同的五个荧光通道进行双管检测。

在血流感染(BSI)的病例中，大约89.3%归因于单一细菌物种的感染(图I)。CCMA与双管策略相结合，可以快速识别由一种或两种病原体引起的BSI病例。该方法适用于98.6%的临床BSI病例。

病原体多重检测panel的性能测试。

图片来源：Nucleic Acids Research

CCMA在临床样品低浓度病原菌检测中的应用

基于CCMA的败血症相关细菌检测panel已应用于45份临床样本，共鉴定出16份阳性样本(如下图)。结果显示，CCMA的测试结果与“金标准”方法具有良好的一致性(98.8%)，而不受样品类型差异的影响。总的来说，在总共45个未知的临床样本中，临床敏感性为88.9%(16/18)，临床特异性为100%(27/27)。低菌载量样品出现2次假阴性结果。

CCMA在临床样品低浓度病原菌检测中的应用。

图片来源：Nucleic Acids Research

总结与讨论

CCMA允许使用传统的qPCR仪器在单管反应中同时筛选许多不同的DNA目标。不同荧光团的Ct值的编程定时延迟为增加CCMA的复杂性提供了一个强大的机制。使用CCMA使用4个荧光通道设计一个用于检测21种败血症相关病原体DNA的大规模多重qPCR panel，作者成功地将CCMA 21种病原菌检测panel应用于临床样品，并将检测结果与“金标准”交叉验证。总体而言，两种方法的鉴定结果显示出相当好的一致性(85%)，无论样品类型的变化。与细菌培养和检测方法相比，CCMA无需细菌培养即可识别临床样品中是否存在细菌，将周转时间从几天缩短到几小时。此外，与传统方法相比，CCMA检测的临床样本量要求大大降低。

设想CCMA在大量靶点的中等复杂情况下承担NGS的角色，例如癌症的综合征检测和伴随诊断检测。目前可用的癌症伴随诊断测试的周转时间为4-14天。CCMA的周转时间预计与常规qPCR分析相似，可能在数小时内。qPCR在时间，成本和易用性方面具有显着优势。