肝豆状核变性（WD）是一种由ATP7B基因突变导致的常染色体隐性遗传铜代谢相关疾病。多数WD患者表现为铜蓝蛋白水平下降和肝功能障碍，包括慢性肝病、失代偿期肝硬化甚至是暴发性肝衰竭，而终末期肝病是WD患者的主要死因之一，因此探索影响WD患者肝病表型的因素具有一定的临床意义。 

既往研究认为WD患者的基因型是影响其肝病表型的重要因素，尤其是在中国WD患者中常见的c.2333G>T/p.R778L突变（R778L突变）和c.2975C>T/p.P992L突变（P992L突变）。有研究认为携带R778L突变的患者更易表现为肝病表型，并且发病更早，铜蓝蛋白水平更低。Zhang等通过大型WD队列研究，发现P992L突变与WD临床表型无关。对于通常会造成蛋白功能严重损害的截断突变，Okada等和Merle等认为其与极低的铜蓝蛋白水平以及早期肝衰竭相关。然而，Ferenci等研究显示，相比于基因型，性别和年龄对WD患者的表型影响更大。因此，关于WD患者基因型和肝病表型的相关性还有待探索，本研究旨在对两者的潜在联系进行探究。

1资料与方法

1.1   研究对象

选取2008年8月—2023年6月在解放军总医院第五医学中心就诊，具有临床症状并接受基因检测的WD患者。WD的诊断标准基于莱比锡（Leipzig）评分系统，所有纳入患者Leipzig评分均≥4，并排除了其他疾病的存在。从病历中提取以下资料用于分析。（1）一般情况：性别和发病年龄；（2）临床表型：肝脏或神经系统症状，以及角膜K-F环检查情况；（3）实验室检查：肝功能、血常规、凝血常规和铜生化；（4）病理学检查结果；（5）影像学检查结果；（6）基因检测结果。 

1.2   研究方法

1.2.1   表型定义和患者分组

根据Ferenci等的分类方法，将肝病表型按照严重程度分为暴发性WD（发病时表现为急性肝衰竭）、失代偿期肝硬化、慢性肝病（慢性肝炎和代偿期肝硬化）。根据ATP7B基因突变情况将患者分为R778L突变组和非R778L突变组；P992L突变组和非P992L突变组；截断突变组和非截断突变组。截断突变包括无义突变和移码突变。 

1.2.2   遗传分析

通过Sanger测序和/或二代测序检测患者ATP7B基因。收集患者及其父母静脉血5 mL，用试剂盒提取血液DNA，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。2014年以前入院的患者，采用Sanger测序对ATP7B基因进行检测。使用Primer3 Plus软件设计测序引物，通过PCR进行扩增。纯化后的PCR产物使用ABI 3730XL DNA Analyzer（Applied Biosystems，美国）进行测序。2014年之后入院的患者进行全外显子测序：对取得的DNA样本进行超声打断，采用KAPA Library Preparation Kit（Roche，美国）试剂构建DNA文库，经探针捕获后的DNA样本在Illumina NovaSeq 6000（Illumina，美国）平台进行高通量测序。测序数据使用Burrows-Wheeler Aligner（BWAv0.7.10）与人类参考基因组（GRCp7/hg19）进行比对。高通量测序鉴定出的候选ATP7B变异经PCR扩增后在ABI 3730XL DNA Analyzer（Applied Biosystems，美国）进行Sanger测序验证。 

2结果

2.1   一般资料

共纳入WD患者163例，男94例，女69例。中位入院年龄9岁，其中≤18岁者139例（85.28%）。中位发病年龄8岁，从发病到确诊的时间为0～19年。有明确家族史者11例，疑似家族史者6例。 

2.2   临床表现

（1）肝脏受损情况：乏力、纳差42例（25.77%），腹痛、腹胀36例（22.09%），皮肤、巩膜黄染28例（17.18%），双下肢水肿18例（11.04%）。ALT或AST升高138例（84.66%），低蛋白血症47例（28.83%）。临床诊断为慢性肝病121例（慢性肝炎82例，代偿期肝硬化39例），失代偿期肝硬化36例（肝硬化合并食管胃底静脉曲张出血15例，肝硬化合并肝性脑病5例），暴发性WD 6例。（2）神经系统受损情况：四肢震颤5例，言语不清、语速缓慢2例，动作迟缓、走路姿势异常2例。（3）角膜K-F环：153例WD患者进行了眼科裂隙灯检查，角膜K-F环阳性59例（38.56%）。（4）铜生化：血清铜蓝蛋白水平降低154例（94.48%）；141例患者进行了24 h尿铜水平检测，其中102例（72.34%）24 h尿铜升高。163例WD患者的具体临床特征分布见表1。 

2.3   ATP基因分析结果

163例患者中纯合子21例，复合杂合子137例，杂合子5例。共检测出90种不同的ATP7B等位基因突变，包括61种错义突变、16种截断突变（11种移码突变/5种无义突变）、10种剪切突变、2种外显子缺失和1种同义突变。如图1所示，外显子8的R778L突变是本研究中最常见的突变（等位基因频率为28.2%），其次是外显子13的P992L突变（等位基因频率为12.6%）。截断突变的等位基因频率为11.0%。163例患者的ATP7B基因突变情况见表2。

图1  ATP7B基因突变等位基因频率分布图

2.4   R778L突变、P992L突变、截断突变在不同肝病表型中的分布比较

R778L突变、P992L突变和截断突变在不同肝病表型患者中的分布比较，差异均无统计学意义（P值均>0.05）（表3）。

2.5   R778L突变、P992L突变、截断突变的WD患者临床特征分析

R778L突变组的血清铜蓝蛋白水平显著低于非R778L突变组（Z=-2.889，P=0.004）；两组间其他指标比较，差异均无统计学意义（P值均>0.05）。P992L组的ALT（Z=2.684，P=0.007）和AST（Z=3.388，P<0.001）水平均显著高于非P992L突变组；两组间其他指标比较，差异均无统计学意义（P值均>0.05）。截断突变组的血清铜蓝蛋白（Z=-3.136，P=0.002）和血清铜水平（Z=-2.296，P=0.025）明显低于非截断突变组；两组间其他指标比较，差异均无统计学意义（P值均>0.05）（表4）。

3讨论

目前已经发现了超过900种ATP7B基因突变，其中约380种具有致病性。东亚地区最常见的突变为R778L突变，等位基因频率在16.7%～37.9%。本研究中R778L突变等位基因频率为28.2%，与既往研究相符，而欧洲常见的p069Q突变未在本队列中发现。ATP7B基因突变是WD的病理生理基础，突变导致ATP7B蛋白（Cu-ATP酶）活性降低，理论上会影响患者的肝病表型，但目前WD基因型表型的相关性尚不明确。 

本研究在163例患者中发现R778L突变与较低的铜蓝蛋白水平有关，该突变导致ATP7B蛋白跨膜区4（TMS4）结构受到严重影响，引起铜离子的排泄障碍，最终使铜蓝蛋白前体无法与铜结合成为铜蓝蛋白而被降解，表现为铜蓝蛋白水平的降低。同样位于TMS编码区的P992L突变主要影响TMS6的结构，然而本研究并未在携带该突变患者中观察到铜蓝蛋白水平下降，但这些患者转氨酶水平较高，提示TMS6对于铜离子运输及铜蓝蛋白合成的影响可能较TMS更小，但TMS6功能受损后对肝细胞损伤更重，其机制有待进一步明确。截断突变通常会造成蛋白结构功能的严重损害，然而未发现其与更严重肝病表型之间的相关性，仅发现携带截断突变的患者表现出更低的铜蓝蛋白和血清铜水平，这种铜生化的损害可能与截断突变体的定位方式存在关联。相对于其他ATP7B突变体多定位于反式高尔基体网络或内质网，截断突变体通常以弥漫性和簇状的形式定位于细胞质内。 

本研究显示R778L、P992L、截断突变均与肝病表型无显著关系，表明在探索影响WD患者肝病表型的因素时，不能局限于基因型。Ferenci等认为相对于基因型，性别与年龄对WD患者表型的影响更大。近年来研究者认为除了ATP7B基因突变，WD表型的形成还可能与DNA甲基化异常、组蛋白修饰异常、染色质重塑等表观遗传学因素以及其他非遗传因素（如环境和性别）有关。因此，在评估WD患者肝病表型时，需要综合考虑这些因素。 

本研究尚存在一定的局限性：（1）本研究为回顾性研究，存在一定的偏倚；（2）本研究对于肝病表型的探讨仅限于首诊时的情况；（3）本队列中合并神经系统异常的患者例数少，因此未进行基因型与WD患者神经表型相关性的探索；（4）未考虑环境、表观遗传学以及其他非遗传学因素的影响。 

综上所述，本研究认为WD患者的基因型和肝病表型无明显相关性，但R778L突变与较低的铜蓝蛋白水平相关，P992L突变与较高的ALT和AST水平相关，截断突变与较低的铜蓝蛋白和血清铜水平相关。

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https://www.lcgdbzz.org/cn/article/doi/10.12449/JCp40819